應(yīng)用易錯(cuò)APCR定向進(jìn)化聚合甘油脫氫酶

經(jīng)過連續(xù)易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Error-Prone PCR)向克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)聚合甘油脫氫酶基因中引進(jìn)驟變，并構(gòu)建驟變文庫(kù)。依據(jù)驟變體催化番紅O顯色的特性，選用瓊脂平板法和96微孔板法相結(jié)合的高通量挑選方法，成功獲得驟變體gldA-74，其酶生機(jī)是親本重組酶的2.73倍。經(jīng)過軟件對(duì)驟變體gldA-74酶基因和親本重組酶基因進(jìn)行剖析比照，發(fā)現(xiàn)驟變體gldA-74酶基因發(fā)生了一處點(diǎn)驟變(A964T)，該驟變使一處氨基酸被替代。將親本重組酶和進(jìn)化酶的高效表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni柱純化后，酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果表明，聚合甘油的Km值由0.58 mmol?L^(-1)升高至0.63 mmol?L^(-1)，而NAD的Km值由0.74 mmol?L^(-1)升高至0.77mmol?L^(-1)，并且酶的最適pH值由本來(lái)的11.5升高至12.5，而最適溫度由65℃降至55℃。